知识库 KnowledgeBase
人体微生物组信息分析平台。量化健康把宏基因组分析内容模块化、标准化、流程化与自动化——从原始测序数据到综合评价报告，知识库将湿实验产出的海量数据转化为可读、可用的功能洞察。
四步分析流程
序列质量过滤
对原始测序数据进行质控与序列比对，输出干净数据。
基因丰度生成
基于比对结果生成基因水平的丰度谱，量化物种与功能基因。
功能性分析
基于通路进行分组（糖类及脂类代谢通路、有益物质生成通路、抗性基因等），并基于元数据并合。
预测模型及报告
叠加疾病预测模型，输出个体微生物组的综合评价报告。
核心分析能力
从原始测序数据到可解读的结果，知识库覆盖物种组成、功能基因、耐药与毒力、生态指标与预测模型的完整分析链路。
丰度量化
门/属/种多层级物种丰度与功能基因丰度。
功能通路
KO/KEGG 通路注释、代谢与生成通路分组。
风险与安全
抗性基因、毒力因子与条件致病菌筛查。
生态指标
多样性、肠型、F/B 比值等微生态生态指标。
预测模型
基于菌群标志物的疾病风险与健康指数模型。
分析与报告
从原始数据到个体化综合评价报告的输出。
分析内容
分析方法一致，按研究设计分为单样本分析与多样本分析两类；下列分析项可按研究目标选择，具体组合与样本要求由项目对接时确定。
单样本分析
单样本分析的内容可直接替代 16S 分析需求。
| 分析内容 | 说明 |
|---|---|
| 序列质控与物种组成 | |
| 质量控制 | 原始测序数据质控报告，去除低质量序列，并按需去除宿主序列 |
| 物种注释 | 基于 MetaPhlAn4 物种标记数据库，输出样本中各分类层级的相对丰度 |
| 功能注释（基于测序数据直接注释，无需组装） | |
| 功能注释 | 基于 HUMAnN3 的功能注释：基因家族、MetaCyc 反应、KEGG 直系同源组、Pfam 结构域、Level 4 酶学编号、eggNOG、Gene Ontology 与 Informative GO |
| 组装与基因集构建 | |
| de novo 组装 | 将质控后的高质量测序数据从头组装为 contigs，并延伸获得 scaffolds 与 scaftigs |
| 基因预测 | 对组装后的 scaftigs 预测开放可读框（ORFs），去冗余得到非冗余基因集 |
| 基因丰度 | 将高质量测序数据 mapping 到非冗余基因集，得到基因水平的丰度数据 |
| 基因功能注释（基于非冗余基因集） | |
| CARD | 抗生素耐药性功能注释 |
| VFDB | 致病毒力因子功能注释 |
| KEGG | KEGG Orthology 功能注释 |
| PHI | 病原-宿主互作数据库功能注释 |
| TCDB | 膜转运蛋白功能注释 |
| QS | 群体感应（Quorum Sensing）注释 |
| MvirDB | 生物防御相关基因注释 |
| CAZy | 碳水化合物水解酶功能注释 |
| COG | COG 数据库功能分类预测 |
| 基因与单菌基因组深挖 | |
| 基因物种注释 | 对非冗余基因集比对 NR 数据库做物种注释 |
| MAGs · 分箱（Binning） | 对 de novo 组装获得的 contigs 进行分箱，获得宏基因组组装基因组（MAGs） |
| MAGs · 丰度定量 | 将测序数据 mapping 到 MAGs 序列获得其丰度信息 |
| MAGs · 物种注释 | 基于 ANI 对 MAGs 做物种注释 |
| MAGs · 进化树 | 基于 MAGs 序列数据构建进化树 |
| 次级代谢产物分析 | 基于组装结果预测次级代谢产物 |
多样本分析
面向组间比较；两组以上及时间序列的分组分析，可另作个性化分析对接。
| 分析内容 | 说明 |
|---|---|
| 菌群组成分析 | 分析不同组之间在各分类层级的组成差异 |
| 多样性分析 | 物种累积曲线（判断抽样是否充分、比较物种丰富度）、Alpha 多样性（香农指数、丰富度、均匀度）、基因丰富度 |
| 降维聚类分析 | PCA 主成分分析、PCoA 主坐标分析、NMDS 非度量多维尺度分析、Enterotype 肠型分析 |
| 组间差异分析 | PERMANOVA 多因素方差分析、MRPP 多响应置换过程分析、组间 wilcox 检验、DESeq2、LefSe |
| 网络分析 | 根据物种丰度在样本中的相关性，构建物种之间的网络 |
| MGS 分析 | 按基因丰度相关性将基因聚类成簇（簇内基因数大于 700 记为一个 MGS），对簇内基因做物种注释并注释到物种 |
| MAG 分析 | 对所有样本做 de novo 组装并分箱得到 MAGs，去冗余得到代表性 MAGs，做物种注释并构建进化树 |
| 机器学习 | 通过随机森林模型构建分类器 |
| 其他分析 | 多元线性关联分析、基于 KEGG Orthology 的通路富集分析、代谢物潜力分析 |
参考数据库体系
分析结果的可信度取决于参考数据库。知识库的数据库按群落（宏基因组）与单菌（细菌基因组）两个层面组织，各自区分基因组与功能基因，配套由基因组预测的代谢模型，并以自建对照数据库为个体报告提供健康范围参照。
宏基因组数据库
群落层面的物种组成与相对丰度解析。
- MetaPhlAn4 物种标记数据库
- NCBI NR 非冗余序列库
宏基因组功能基因库
功能基因、酶与代谢通路的注释与富集。
- KEGG（KO / Pathway）
- eggNOG、COG（同源簇／同源蛋白簇）
- Gene Ontology（含 Informative GO）
- Pfam（蛋白结构域）、MetaCyc（代谢反应）
- CAZy（碳水化合物活性酶）
细菌基因组数据库
细菌基因组比对与物种鉴定。
- NCBI 细菌基因组库
- GTDB 基因组分类数据库
- ANI 参考基因组库
细菌功能基因库
耐药、毒力、转运与生物防御功能筛查。
- CARD（抗生素耐药基因）
- VFDB（毒力因子）
- PHI（病原-宿主互作）
- TCDB（膜转运蛋白）
- MvirDB（生物防御相关基因）
- Quorum Sensing 群体感应注释库
细菌代谢模型库（基因组预测）
由基因组预测代谢能力，支撑代谢层面的解读。
- 基于基因组预测的代谢网络模型
- 次级代谢产物预测
- 物种-代谢物关联的代谢物潜力分析
量化健康对照数据库
报告指标的健康人群对照基线。
- 基于自有样本积累构建的对照库
- 为生态指标、健康范围与百分位提供参照
- 按版本管理，报告页标注本次所用的对照数据库与版本
宏基因组测序 vs 16S 测序
菌群研究日益要求把菌群解析到菌种水平，这是 16S 扩增子测序难以达到的；宏基因组测序直接从样本中全部微生物的 DNA 出发，同时给出物种与功能两方面的信息。
| 维度 | 16S 测序 | 宏基因组测序 | 差异 |
|---|---|---|---|
| 测序对象 | 某一高可变区 | 样本中全部微生物的总 DNA | 覆盖更全面 |
| 测序原理 | PCR 扩增后测序 | 微生物基因组 DNA 随机打断为约 350 bp 片段后测序 | — |
| 数据量 | 平均 3～4 万条 clean tags／样本 | 1 G 起（约 660 万 reads raw data 以上）／样本 | 数据量更多 |
| 偏向性 | 探针与 PCR 引入偏向，可能造成假阳性结果 | 存在序列组份（GC）偏向 | 偏向更小 |
| 物种鉴定 | 属水平，部分可预测到种 | 种／株水平，低丰度微生物可提高测序深度获取 | 深度与准确度更佳 |
| 物种注释 | RDP、Greengenes 等，主要覆盖细菌 | NCBI 等数据库，覆盖细菌、真菌、古菌、病毒的基因片段 | 注释信息更多 |
| 功能分析 | 间接预测，仅到 KEGG 第三层级 | 由基因序列直接注释，覆盖酶、代谢与合成通路、膜转运、信号传递等 | 更准确、更全面 |
| 研究目的 | 群落组成、进化关系与多样性的监测 | 物种与丰度检测、功能与互作研究，可挖掘新物种、新基因 | 适用面更广 |
宏基因组测序一次覆盖上万种微生物，可解析到菌种水平，并获得功能基因注释与代谢通路信息。
浅层宏基因组（1 Gb）与 16S 的对照实测
量化健康与合作单位 2021 年发表于 Frontiers in Microbiology 的研究，把 16S、1 Gb 浅层宏基因组（S-WMS）与深度宏基因组放在同一批样本上做对照：两个自建人工菌群（69 种／33 属；62 种／28 属，各菌丰度按人群真实分布设置）与 59 例真实粪便样本。下表数值引自该文[1]。
| 对比指标 | 16S 测序 | 浅层宏基因组（1 Gb） |
|---|---|---|
| 属水平一致性（59 例粪便样本，Spearman 相关系数） | 0.407 | 0.806 |
| 属水平召回率（参照同批深度宏基因组） | 47.5% | 63.6%；丰度 > 0.02% 的属可达 88.8% |
| 误报属比例（人工菌群，低／高复杂度） | 37.8% ／ 40.8% | 12.0% ／ 28.6% |
| 读段可被深度宏基因组匹配 | 84.1% | 99.9% |
| 属丰度与已知组成的相似度（高复杂度人工菌群） | 0.61 ± 0.03 | 0.77 ± 0.03（p < 0.001） |
| 种水平分析 | 通常止于属水平 | 可解析到种：召回 58.5%，丰度 > 0.03% 的种达 91.6% |
| KEGG 功能预测（一级／二级通路） | 与已知功能组成有明显偏差 | 与已知功能组成基本一致 |
参照系说明：属／种召回率与一致性以同批样本的深度宏基因组结果为参照；误报率、丰度相似度与功能预测以人工菌群的已知组成为参照，人工菌群每种方法各测 5 次。三级通路上 16S 与浅层宏基因组的预测都达到可用水平，差异主要出现在一级与二级[1]。同一研究也比较了 0.5 Gb 与 1 Gb：两者在属水平都接近深度宏基因组，但按 1 Tb／芯片计算，0.5 Gb 会明显拉长凑样周期，故以 1 Gb 作为常规工作深度；该深度的信息量也与前人研究结论一致[2][3]。
16S 结果为什么会偏离
该研究把偏差归因于 16S 方法本身的几个固有特性[1]：
- 引物覆盖不均：常用 16S 引物对不同类群的扩增效率差异较大，有研究报告可漏掉约一半的 rRNA 多样性[4]
- 系统发育关系偏差：部分类群基于 16S 与 23S 的进化关系不一致，会影响分类归属[6]
- 16S rRNA 基因拷贝数差异：不同细菌基因组中该基因的拷贝数不同，直接以序列数换算丰度会引入系统偏差[5]
- 实测表现：该研究中，深度宏基因组检出的部分优势属（相对丰度 > 1.5%）16S 未能检出；而实际丰度极低的 Porphyromonas 被 16S 给出 13.4% 的相对丰度
参考文献
- Xu W, Chen T, Pei Y, Guo H, Li Z, Yang Y, Zhang F, Yu J, Li X, Yang Y, Zhao B, Wu C. Characterization of Shallow Whole-Metagenome Shotgun Sequencing as a High-Accuracy and Low-Cost Method by Complicated Mock Microbiomes. Frontiers in Microbiology, 2021; 12: 678319. doi: 10.3389/fmicb.2021.678319。量化健康为参与单位之一；上文对照表数值（属／种召回率、误报属比例、读段匹配率、丰度相似度、KEGG 功能预测比较与 0.5／1 Gb 深度比较）均引自该文。
- Jovel J, Patterson J, Wang W, et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology, 2016; 7: 459.
- Hillmann B, Al-Ghalith GA, Shields-Cutler RR, et al. Evaluating the information content of shallow shotgun metagenomics. mSystems, 2018; 3: e00069-18.
- Hong S, Bunge J, Leslin C, Jeon S, Epstein SS. Polymerase chain reaction primers miss half of rRNA microbial diversity. The ISME Journal, 2009; 3: 1365–1373. doi: 10.1038/ismej.2009.89
- Kembel SW, Wu M, Eisen JA, Green JL. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Computational Biology, 2012; 8: e1002743. doi: 10.1371/journal.pcbi.1002743
- Dewhirst FE, Shen Z, Scimeca MS, et al. Discordant 16S and 23S rRNA gene phylogenies for the genus Helicobacter: implications for phylogenetic inference and systematics. Journal of Bacteriology, 2005; 187: 6106–6118.
以上为公开研究数据，用于说明方法学差异；不同样本类型、实验流程与分析版本下数值会有差异。
交付内容与服务周期
分析以项目方式交付：实验与测序环节的报告和原始数据，配合所选分析模块的结果数据与解读说明。
交付内容
- 样本 DNA 提取质控报告与建库质控报告
- DNA 提取与建库实验步骤方法概述，测序平台与策略概述
- 测序数据质控、序列组装与基因预测及其质控结果
- 测序原始数据，以及样本编码对照表
- 结果文件的命名、目录、存储路径与打开浏览方式说明
- 按所选分析模块，给出分析步骤概述、结果数据与解读概述
交付周期
30 天，自样本抵达实验室起计算周期，如遇节假日顺延。
售后服务
分析结束后三个月内，可就合同服务方案内的交付内容咨询相关对接服务人员。
个性化分析
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